GlycoRNA-seq
GlycoRNA-seq技术简介 GlycoRNA-seq是一项创新的测序技术，专门用于分析糖基化RNA（GlycoRNA），这是一种在细胞表面发现的新型RNA
GlycoRNA-seq
技术简介
GlycoRNA-seq是一项创新的测序技术，专门用于分析糖基化RNA（GlycoRNA），这是一种在细胞表面发现的新型RNA修饰。GlycoRNA的发现归功于斯坦福大学的Bertozzi和Flynn教授团队，他们在2021年揭示了这一科学现象。GlycoRNA包含多种非编码小RNA分子，例如YRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和rRNA等，它们携带特定的糖分子，并在免疫调控等关键生物学过程中发挥作用。
GlycoRNA-seq技术在研究GlycoRNA在不同物种、组织和细胞类型中的表达模式、功能差异以及修饰特征中具有广阔的应用前景。此外，GlycoRNA-seq技术还可以探索GlycoRNA的调控机制，包括它们与其他分子的相互作用，以更好地理解其在生物学过程中的作用。值得注意的是，GlycoRNA-seq技术的应用有助于识别与疾病相关的GlycoRNA生物标志物，这可能为开发新的治疗策略提供线索。另外，GlycoRNA-seq技术的应用有利于研究药物对GlycoRNA表达和修饰的影响，对开发出基于GlycoRNA的新型治疗药物提供了研究手段，为医学领域带来了新的突破。
为了探究GlycoRNA在生物学过程中的作用，云序生物推出了GlycoRNA-seq测序服务。对于细胞样本，该技术使用报告糖（如:Ac4ManNAz）对细胞进行代谢标记，细胞会把报告糖整合到GlycoRNA上，标记好的GlycoRNA与生物素连接，用磁珠抓取带有生物素的GlycoRNA，实现GlycoRNA的标记。
对于无法体外培养的样品，可以使用rPAL法，对抽提的RNA进行标记，用高碘酸盐将GlycoRNA糖链末端的“尾巴”氧化成醛基，醛基会和生物素反应，把生物素连接到GlycoRNA上，用磁珠抓取生物素标记的GlycoRNA，从而实现GlycoRNA的标记。
这两种方法为GlycoRNA的研究提供了强大的工具，使得研究人员能够更精确地识别和分析GlycoRNA的表达模式、功能差异以及修饰特征，进而揭示其在生物学过程中的重要作用。
实验流程
1. 报告糖（如:Ac4ManNAz）对细胞进行代谢标记
1.代谢标记：使用Ac4ManNAz（叠氮修饰甘露糖）对细胞进行代谢标记，将叠氮基团整合到GlycoRNA的唾液酸残基上。
2.RNA提取：使用TRIzol裂解细胞提取总RNA，随后使用高浓度蛋白酶K消化蛋白，并通过硅胶柱纯化RNA。
3.点击化学反应：将提取的RNA与DBCO-PEG4-biotin（生物素标记）进行点击化学反应，将生物素标记到RNA上。
4.亲和纯化：使用链霉亲和素磁珠进行亲和纯化，以富集带有生物素标记的GlycoRNA。
5.质检和建库：洗脱GlycoRNA后进行质检，合格的样本进行建库，准备进行测序。
6.高通量测序：利用高通量测序平台对建库后的GlycoRNA样本进行测序，以获取GlycoRNA的种类、丰度、序列特征和修饰模式等信息。
7.数据分析：包括原始reads过滤、质量控制、基因组比对、与miRNA、rRNA、tRNA等database比对、各类sncRNA定量分析、sncRNA长度及分类统计、序列TOP20饼图和柱状图、miRNA、tRNA、tsRNA、rsRNA等表达差异分析、差异表达sncRNA聚类分析等。
2. RNA优化的高碘酸盐氧化和醛连接法（rPAL）
1.RNA纯化：使用高浓度蛋白酶K消化提取后的RNA样本中的蛋白质，随后通过硅胶柱纯化RNA。为去除可能残留的DNA污染，加入无RNase的DNase进行处理，确保RNA样本的纯度。
2.高碘酸盐氧化：在温和高碘酸氧化条件下 (7.5mM NaIO4, 10 分钟，室温)对RNA中的糖基化部分进行选择性氧化，与GlycoRNA上唾液酸中的邻二醇发生特异性反应，将唾液酸二醇氧化为醛基。
3.醛连接反应：将氧化后的醛基与含有胺基的生物素标记试剂进行连接反应，从而实现GlycoRNA的特异性标记。
4.富集与洗涤：使用链霉亲和素磁珠（Streptavidin beads）对生物素标记的GlycoRNA进行富集。通过强力洗涤步骤去除未结合的非糖基化RNA及其他杂质。
5.质检和建库：洗脱GlycoRNA后进行质检，合格的样本进行建库，准备进行测序。
6.高通量测序：利用高通量测序平台对建库后的GlycoRNA样本进行测序，以获取GlycoRNA的种类、丰度、序列特征和修饰模式等信息。
7.数据分析：包括原始reads过滤、质量控制、基因组比对、与miRNA、rRNA、tRNA等database比对、各类sncRNA定量分析、sncRNA长度及分类统计、序列TOP20饼图和柱状图、miRNA、tRNA、tsRNA、rsRNA等表达差异分析、差异表达sncRNA聚类分析等。
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产品优势
1.能检测低丰度的GlycoRNA，提供全面、精细的GlycoRNA图谱。
2.同时获取多类型的、带有特殊糖修饰的sncRNA。
3.测序数据可以进行精确的定量分析，比较不同样本间GlycoRNA表达水平的差异。
4.分析信息丰富，包括序列信息、各类sncRNA表达差异分析和糖基化位点等。也可结合质谱分析，推测GlycoRNA上聚糖的类型和结构、不同样本间聚糖组成的差异等
样品量及要求
1.细胞样本：
报告糖对细胞进行代谢标记：（1）未经Ac4ManNAz处理的细胞样本：需要2×10^6个细胞（可以是活细胞或冻存细胞，需要详细标明培养条件）。
（2）经Ac4ManNAz处理的细胞样本：需要≥3×10^6个细胞。Ac4ManNAz处理方法是每个反应铺板1.5-2×10^6细胞（细胞密度为30%），加入10 ml含有100 μM Ac4ManNAz的培养基，培养48小时后，用胰酶消化下细胞，加入Trizol裂解液，干冰储存运输。
rPAL：≥2×10^6个细胞
2.总RNA样本：
报告糖对细胞进行代谢标记：经Ac4ManNAz处理的细胞样本提取的总RNA需要≥25 μg ；RIN（RNA完整性数）≥6。
rPAL：经高碘酸氧化的总RNA需要≥25 μg；RIN（RNA完整性数）≥6。
3.RNA样本的保存和运输：
RNA样本需要在-80℃条件下保存，并使用干冰进行运输。如果样本在送样前已经自行质检，需要提供样本浓度、体积、总量、所用溶剂等相关信息，并说明样本检测所用方法或设备。
4.其他注意事项：
（1）确保样本在运输过程中不会因为温度变化而影响质量，因此干冰的量需要足够，运输时间最好不要超过72小时。
参考文献
[1] Zhang, Ningning et al. Cell surface RNAs control neutrophil recruitment. Cell vol. 187,4 (2024): 846-860.e17. doi:10.1016/j.cell.2023.12.033
[2] Xie, Yixuan et al. The modified RNA base acp3U is an attachment site for N-glycans in glycoRNA. Cell vol. 187,19 (2024): 5228-5237.e12. doi:10.1016/j.cell.2024.07.044
案例分析
原文：Cell surface RNAs control neutrophil recruitment
期刊：CELL 发表时间：2024.1.22 影响因子：45.5
本研究报道了细胞表面RNA对中性粒细胞募集至关重要，并且GlycoRNA的表达需要Sid-1 RNA转运体的哺乳动物同源物。在小鼠中性粒细胞中可以很容易地检测到细胞表面RNA，并且这种RNA的消除大大削弱了中性粒细胞在体内向炎症部位的募集，并减少了中性粒细胞对内皮细胞的粘附和迁移。中性粒细胞GlycoRNA主要位于细胞表面，对中性粒细胞与内皮细胞的相互作用很重要，而且可以被p选择素(Selp)识别。另外，小鼠Sidt基因的敲低会消除中性粒细胞GlycoRNA，并在功能上模仿细胞表面RNA的丢失。本研究的结果强调了细胞表面GlycoRNAs在调控中性粒细胞与内皮细胞相互作用以及在炎症反应中的关键作用，并指出了Sidt基因在这一过程中的重要性。简言之，这项研究揭示了细胞表面RNA在免疫细胞招募和炎症反应中的新作用；阐明了RNA糖基化在调控细胞间相互作用中的生物学重要性。同时，该研究为理解RNA在细胞表面的功能以及开发潜在的治疗策略提供了新的视角。
