超级准确的定量：数字PCR(digitalPCR)
数字PCR即Digital PCR（dPCR)是这几年才迅速发展起来的一种核酸定量分析技术，虽然技术比较新，但是潜力巨大，因为数字PCR解决了qPCR这么多年悬而未决的问题，那就是不依赖于标准曲线的绝对定量并且可以将检测灵敏度提高至单个核酸分子。
数字PCR通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元（微滴），包含一个或多个拷贝的核酸分子(也就是说我们所说的 DNA 模板) ，这是与PCR或qPCR反应最大的区别，PCR或qPCR只在一个反应体系中进行，而数字PCR在每个反应单元（微滴）中都会对目标分子进行扩增，扩增结束后统计荧光信号并分析。举个例子，PCR或qPCR检测突变像是在大海里捞一个会发光的针，周围都是海水，很难看到针的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多个碗里面，瞧一眼很容易就知道哪个碗在发光了，而且，系统还会数出来到底有多少个碗里是发光的，多少个碗里是没发光的，这样一比，就很容易的知道有多少数量的突变，就能做到绝对定量了。
PCR能以卓越的灵敏度和准确度测量癌症突变的变异程度、检测稀有的DNA靶拷贝以及解析拷贝数变异状态；精确地对靶DNA或RNA分子中的细微变化进行定量分析，从而检测和监测病原体。
一．痕量核酸检测
dPCR尤其适合：对灵敏度要求非常高的核酸痕量分析研究；基质复杂样品中的核酸准确定量（如组织、体液、排泄物等样品）。
1.1癌症标志物稀有突变检测
在一份给定的样本中，相比于野生型DNA，癌症相关的突变序列比例较低，经常无法检测。而凭借其超高灵敏度，dPCR系统可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突变频率。之前用任何方法都无法实现准确稳定检测的样本，现在可以使用dPCR轻松进行定量分析。
是否能够开发出有效的靶向治疗药物，与突变基因的检测密切相关。其中（1）携带药物作用突变位点的癌细胞百分比；（2）突变的特定等位基因是否可以被准确检测到，这两点都直接影响到靶向治疗是否有效。很显然，在肿瘤均质细胞内检测单一突变相对简单，但是如果在异质组织内，在仅存有少量突变存在的情况下，如何准确检测出突变/稀有变异，或者针对于同一种癌症中多种亚克隆的准确鉴定，对个性化医疗的发展是一个巨大的挑战。
案例一
实现肺癌相关的表皮生长因子受体（EGFR）中T790M突变的检测，可以更好地评估抗酪氨酸激酶抑制剂的治疗。然而，由于其他技术检测灵敏度有限，无法在高背景EGFR野生型中可靠地检测到T790M突变。研究人员使用dPCR技术开发出精确度很高的检测方法，以准确定量T790M的浓度[1]。
1.2致病微生物检测
精确的病毒载量分析对于阐释疾病病程，后续治疗及疗效评估是至关重要的。病毒载量的波动，即使只下降了非常低的水平，意义却是显著的。在对病原体的研究中，能否实现准确而可靠的病毒DNA或RNA定量分析，关系到实验的成败。
案例二
研究人员比较了 qPCR 和 dPCR 方法检测临床样本中残留的人类免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染婴儿。研究人员发现，在检测百万个细胞内的 HIV DNA拷贝数时，相比于 qPCR，dPCR 的灵敏度提升了5倍；在检测病毒长末端重复序列时，dPCR比qPCR灵敏提升了20倍[2]。
案例三
研究人员探索HBV血清学和ddPCR检测结果与肝细胞癌（HCC）临床分期和病症之间的关系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在检测FFPE处理的肝癌患者组织样品中HBV DNA时，遇到的准确度、灵敏度和重复性不足的缺点。进而得出以下结论： 1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-time PCR更高——131个待测样品中HBV DNA浓度范围为1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24个血清学检测呈阴性的样本中也检测到了痕量的HBV DNA； 3、样品中HBV DNA的含量与肝细胞癌（HCC）组织的临床分期一致； 4、ddPCR技术可以用于肝癌的早期无创诊断，病程监控，肝移植、化疗或免疫抑制的疗效评估[3]。
二．与新一代测序（NGS）的无缝对接
相对于NGS， dPCR可以富集待测序样品中的靶基因; dPCR还可以验证 / 精确定量测序结果。
案例四
研究人员探索HBV血清学和ddPCR检测结果与肝细胞癌（HCC）临床分期和病症之间的关系中，ddPCR成功的克服了real-time PCR（qPCR）在检测FFPE处理的肝癌患者组织样品中HBV DNA时，遇到的准确度、灵敏度和重复性不足的缺点。进而得出以下结论： 1、ddPCR的灵敏度和准确度比real-time PCR更高——131个待测样品中HBV DNA浓度范围为1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24个血清学检测呈阴性的样本中也检测到了痕量的HBV DNA； 3、样品中HBV DNA的含量与肝细胞癌（HCC）组织的临床分期一致； 4、ddPCR技术可以用于肝癌的早期无创诊断，病程监控，肝移植、化疗或免疫抑制的疗效评估[3]。
三．基因表达分析
实时荧光定量PCR 常用于检测基因表达差异，但该方法一般只能检测出两倍或者更大的差异。而一些研究则需要检测低于两倍的表达变化。dPCR 的检测精度可达±10%甚至更高，能够分辨更小的差异。
dPCR尤其适合：基因相对表达变化差异较小（<2倍）的研究；低丰度基因或单细胞的表达分析，以及RNA编辑、等位基因差异表达等研究。
四．拷贝数变异分析
拷贝数变异 (CNV) 分析的目的是确认目的序列的拷贝数是否偏离野生型序列，以及偏差多少。拷贝数变异与疾病（癌症）、代谢途径、生物种进化等关系密切。临床上，CNV可为具体治疗方案的制定与修正提供参考；农业及畜牧业，CNV可作为遗传育种的遗传标记。
传统实时荧光定量PCR平台提供了足够的分辨率，可以鉴别低拷贝数 (如0至5的拷贝数)；但更高的拷贝数需要更精确的测量，以确定确切的拷贝数。dPCR尤其适用于更高拷贝数分析，检测精度超过±10%。
参考文献：
1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.
2. Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(19): 1828-1835.
3. Huang J T, Liu Y J, Wang J, et al. Next generation digital PCR measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clinical chemistry, 2015, 61(1): 290-296.
4. Cai J, Miao X, Li Y, et al. Whole-genome sequencing identifies genetic variances in culture-expanded human mesenchymal stem cells[J]. Stem cell reports, 2014, 3(2): 227-233.
