一、检测方法介绍

1、测序法

Sanger测序是DNA序列分析的经典方法，可直接获取核酸序列信息，是SNP检测的“金标准”。而且，Sanger测序可发现未知的 SNP位点，确定SNP 的突变类型和突变位置，是一种无法替代的最直接、最准确的SNP检测方法。

采用测序法检测SNP时，首先可将含有SNP位点的靶标序列通过PCR扩增形成DNA片段后，再利用Sanger测序获取目标区域的核酸序列，并对SNP位点进行比对，由此即可确定是否存在变异位点。

Sanger测序是基于双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)末端终止的方法进行检测的。即在四个单独的反应体系中，分别对应掺入四种带有不同颜色标记的A、T、G、C双脱氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定点开始延伸反应，而延伸过程中若掺入ddNTP，则由于碱基上无3’-OH导致延伸无法继续，从而随机在某一特定碱基处终止，形成相差一个碱基的不同系列长度的核酸片段，再利用毛细管电泳分离这些不同长度的核酸片段，最后通过不同碱基标记的颜色读取待测核酸的碱基序列，由此获得目标区域的核苷酸序列。

2、TaqMan探针法

TaqMan探针是一种双标记、自淬灭的水解探针，其5’和3’末端分别标记荧光基团和淬灭基团，在探针结构完整时两者距离较近，荧光基团的信号可被淬灭。而在PCR扩增过程中，若TaqMan探针与靶标序列完全匹配，探针则可结合在DNA模板上，此时Taq酶延伸至探针位置时，其外切酶活性将切割水解探针，释放荧光基团，使得荧光信号增强。而且，随着扩增产物的增多，荧光信号越来越强，从而可通过仪器实时监测荧光信号的变化过程。

针对双等位基因SNP，可分别设计两种对应的探针，只有探针与模板完全匹配时，在扩增扩增过程中探针可被水解产生较强的荧光信号，而如果探针与靶序列之间存在错配，其荧光强度将会减弱，由此可通过荧光强度检测SNP位点。

而由于MGB探针的长度可以设计得更短，有利于提高探针的识别特异性，因此用于检测SNP的TaqMan探针常用MGB修饰。但在测试时，需筛选测试较多的探针，探针合成成本相对较高。

3、ARMS-PCR法

扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是基于Taq DNA 聚合酶无法修复引物3’末端的单个碱基错配，从而使得扩增受阻的检测方法。在扩增过程中，只有当引物3’末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能正常延伸扩增；而当引物3’末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则不发生扩增反应，由此对扩增产物进行凝胶电泳或荧光PCR检测，则可确定SNP基因型。

在ARMS-PCR基础上也发展出了一些改良方法，如四引物扩增阻滞突变系统 PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR)。该方法设计了四条引物，其中两条为3’末端位于SNP位点上的内引物，两条引物方向相反，且分属于不同基因型；另外两条为通用外引物，且两条引物与SNP位点的距离应不一样。这样，在反应过程中，若四条引物均与模板完全匹配，则可扩增出三种长度不一的产物(两条内引物位于同一位点上，无长片段扩增产物形成)；而如果两条内引物中有一条引物与模板不匹配，则只形成两种不同长度的产物，因此，根据电泳后产物大小即可判断基因型。

然而，由于凝胶电泳检测时间较长，而且开盖进行产物分析易造成污染，因此市面上使用ARMS-PCR方法开发的产品，大部分采用了闭管检测的实时荧光PCR。ARMS-PCR法的荧光PCR检测时，同样使用TaqMan探针，只是将SNP位点设计在引物3’末端，因此理论上只有引物3’端与模板完全匹配时，才能形成扩增曲线；但在实际检测时，单个碱基的错配依然可以延伸扩增，只是效率较低。为了提高其特异性，有时需在靠近引物3’末端的位置人为引入错配碱基，以降低非靶标序列的扩增效率。

4、分子信标法

分子信标是一段双标记的寡核苷酸探针，其5’末端和3’末端分别标记荧光基团和淬灭基团，且探针5’端和3’端的部分碱基可互补配对，从而形成茎环结构，使得荧光基团和淬灭基团相互靠近而荧光信号较低。分子信标的环状结构部分包含SNP检测位点，当模板与分子信标环状结构的核酸序列完全匹配时，分子信标可与模板杂交形成伸展状态，从而导致荧光基团和淬灭基团的空间距离拉大，荧光信号增强，因此可被仪器检测，并确定SNP位点。

而使用不同荧光基团标记分子信标，则可区分SNP类型。该方法与TaqMan探针法类似，均是通过探针中单个碱基的识别能力区分SNP。只是分子信标采用茎环结构，而TaqMan探针使用MGB修饰，以提高探针对SNP的识别特异性。

5、高分辨率熔解曲法

高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis, HRM)是通过特定染料与扩增后产物结合后形成特定的熔解峰进行分析检测的方法，其使用的特料为饱和荧光染料，具有更强的DNA结合能力，且不影响PCR扩增，在DNA解链过程中也不会发生重排，使得熔解曲线具有更高的分辨率。

核酸片段的固有特性，如DNA序列的长度、GC含量和碱基互补性差异等，均能影响高分辨率熔解曲线，而结合高精度荧光定量PCR仪，其分辨精度则可达到对单个碱基差异的区分，从而可用于确定SNP位点。

6、CAPS法

酶切扩增多态性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)，又称限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)，是PCR技术与RFLP技术相结合的检测方法。该方法基于DNA片段在酶切位点上的碱基变异，采用相应的限制性内切酶，对该DNA片段的PCR扩增产物进行酶切，从而产生不同的电泳图谱，由此确定SNP位点的碱基类型。

CAPS仅能检测位于酶切位点处的SNP，对于酶切位点以外的SNP则无法检测。为了解决这个不足，对于那些不能采用CAPS检测的SNP位点，可以使用衍生酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)进行检测，即通过在引物上引入错配碱基创造酶切位点，进而实现多态性检测。